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离心机相关的分离知识汇总
发布时间:2012-05-07浏览:3377次


*章离心机及转子的分类:

一.离心机的分类:

国际上对离心机的分类方法有三种:按用途分、按转速分和按结构分。

按用途分类:分为制备型离心机和制备分析离心机。

制备型离心机:仅供分离浓缩,提纯试样的离心机。

制备分析离心机:不但能分离浓缩、提纯试样,而且可以通过光学系统对试样的沉降过程进行观察、拍照、测量、数字输出、打印自动显示的离心机。

按转速分类:分为低速离心机、高速离心机、超速离心机。

低速离心机:转速在10000rpm以内或相对离心力在15000×g以内。

高速离心机:转速在10000~30000rpm以内或相对离心力在15000~70000×g以内。

超速离心机:转速在30000rpm以上或相对离心力在70000×g以上。

按结构分类:

一般在高速和低速离心机根据结构和功能进行分类,品种繁多,各厂家命名也无统一标准。可分为台式离心机、多管微量台式离心机、细胞涂片离心机、血液洗涤台式离心机、高速冷冻离心机、大容量低速冷冻离心机、低速冷冻离心机、台式高速冷冻离心机、台式低速自动平衡离心机等。另外国外还有三联式(五联式)高速冷冻离心机,专作连续离心用。

 

二.转子的分类应用及特点

转子是离心机用于分离试样的核心部件,转子规格、品种的多少是衡量离心机生产技术掌握程度的重要标志,转子一般可分为下列五大类:

固定角转子(Eixed-Angle-Rotor):

主要用于分离沉降速度有明显差异的颗粒样品。颗粒在扇形溶地移动的距离很短,碰到外壁的颗粒沿着管壁滑到管底,形成沉淀,因此这样转子能很快地收集沉淀物。分离过程中,由于管壁的作用,在离心管内将会引起强烈的对流,对具有相同沉降速率的颗粒会产生不良影响。

水平转子(Siwing-Bucket-Rotor):

主要用于样品作密度梯度离心。颗粒移动距离长,溶液中的组分相对于管壁的位置在离心过程中和离心后不发生改变,因此离心效果好,但因颗粒在离心场中是从旋转中沿径向散离出去,而不是按相互平行的路线沉降。颗粒碰到外壁沿着管壁滑到管底,因此也会产生对流。(但比固定角转子小)低速时启动或停机时会产生振动,影响分离效果,水平转子有敞开式和封闭式两种,一般制备容量大,转速小于10000RPM,离心力场在16000×g以内的,作成敞开式,主要用于样品的初分离。制备容量较前者小,转速大于10000RPM,离心力场在16000×g以上的,为了减少风力的影响,一般作成封闭式,主要用于线粒体、叶绿体、细胞核等的分离和密度梯度离心。

连续离心转子(Continuous-Flow-Rotor):

主要用于悬浮介质中高速分离较小的颗粒物质,如在培养基中分离细胞,在运转过程中,悬浮样品以一定速度从转子体中心流入离心池,由于溶液中的组分轻重不同,在离心力场作用下,重粒子具有较大的惯性离心力、沉降快,当流速增大(降低)到一定值时,重粒子将留在离心池外缘底部,而介质将从出口流出并带走较轻的粒子,收集组分的方法是把组分冲洗出离心池或者留在转子体内,这种转子是利用离心淘析技术队整细胞或大的亚细胞粒子进行分离,在无菌和低温条件下,被分离的组分,能保持活性,回收率高等优点。如果液流方向与离心力方向相反,即降低了粒子运行速度,相当于增长了运行距离,从而提高了分辨能力。

区带转子(Zonal-Rotor):

主要用于大容量的密度梯度离心,当实验所需制备的样品量多,而水平转子因受到量的限制时,采用区带离心是较好的。主要由带有四块叶片的转子体和密封系统组成,转子体和四块叶片将离心池分为四个扇形小室,阻止溶液在离心池中旋转,叶片上有径向导管,溶液通过导管从中心流向转子体外壁,装样和取样时应小心,装样一般在2500~3000rpm运转中进行,首先将梯度液中较轻的部分通过密封管道泵入转子内,由于惯性力的存在,梯度液在转子外壁的垂直方向形成均匀的一层,再依次将密度较高的梯度液泵入,随着密度的增高和梯度液的不断泵入,密度较低的梯度液被推向中心,直到转子完全装满,然后通过密封组件中心输液管把待分离的样品(其密度与梯度液中zui轻的密度部分还低)加入,接着把密度更低的溶液注入,用以取代中心附近的样品,装完后,移去密封组件,盖上转子盖,在一定转速离心一定时间后,转速降至2500~3000rpm,装上密封组件及输液管,通过泵入较密的液体到转子的液体由轻至重依次挤出。

区带转子避免了用离心管所引起的壁效应(Walleffects)和干扰,提高了分辨率。

主要用于样品在短时间作密度梯度离心。水平转子分离粒子位移距离长,分辨能力高,分离后组分的区带较宽,便于回收,但所需时间长,垂直转子分离的粒子位移距离等于离心管直径。转子转动前,管内密度梯度溶液的密度是沿重力方向变化,转动后,溶液的密度逐渐改变为离心力方向(水平方向)变化,离心结束后,溶液的密度变化方向因重力作用又沿铅垂方向变化,形成铅垂方向的密度梯度,由于离心管是垂直放置,所以溶液粒子位移的距离等于离心管的直径。离心时间短,离心后样品组分的区带较宽,但因离心时间短,粒子得不到充分分离,将会失去一些组分,又因区带与梯度介质的接触面大,易于扩散,停机后密度重新定向,易于混合,所以作区带离心的效果,垂直转子不于水平转子。

离心机转子的转速跟转子的材料和强度有关,一般采用强度好、重量轻的超硬铝合金(LC4),超速离心机采用钛合金(TiC4)。一般来说,对同一离心机重量轻、容量小的转子转速要高,反之转速要低。转子的保养及寿命管理在以后的章节中介绍。

 

 

第二章基本概念

一、关于相对离心力(relative centrifugal force,RCF)

当装有样品溶液的离心管、瓶、或袋的转子置于与马达相接的转轴上时,通过马达提供的动力会使转子快速旋转,离心技术正是利用这种高速旋转产生的离心力达到使样品溶液中不同性质的颗粒得以相互分开的目的,离心力的大小与旋转速度以及旋转半径成正相关性。由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同,离心力而受变化,因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力,只要RCF值不变,一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。

RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

F离=M×ω2×r

M:运动物体的质量

ω:运动物体的角速度

r:运动物体的质量半径

然而,圆周运动的物体,除受离心力作用外,还受到重力的影响。因此,通常用相对离心力(RCF)来比较不同型号的转子以及转子在不同速度旋转时离心力的大小,公式换算如下:

RCF=F离/F重=Mω2r/Mg=ω2r/g

由于:ω=2πn/60

n:转速(rpm)

r:旋转中心至转头内离心管某一部位的半径(cm)

g:为地球重力加速度(980cm/sec2)

所以:RCF=1.118×10-5×n2×r

为了计算转子的zui大离心力,必须知道离心机使转子旋转的zui高速度(nMax)以及转子的zui大半径(rMax),即离心管底至主轴间zui大距离。

例如:6Ds4.2转子所允许的zui大转速为4200rpm,其zui大离心半径为25.4cm,因此该转子的zui大相对离心力为:

RCFMAX=1.118×10-5×25.4×42002=5018×g

如果这一转子以2000rpm离心时,它的相对离心力为:

RCF=1.118×10-5×25.4×20002=1138×g

由于RCF值随着转速的平方而增大,因此转速的变化会引起RCF更大的变化。

在上式的基础上,Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图,见下图,在用图1将离心机转数换成相对离心力时,先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数,然后将这两点简划一条直线,在图中RCF标尺上的交叉点,即为相应的离心力数值。例已知离心机转数为2500rpm,离心机的半径为7.7cm,将两点连接起来交于RCF标尺,此交点500×g即是RCF值。

为了使某一特定转子的离心条件能在另一个类型的转子上重复并获得同样的分离效果,应该考虑到下述相对离心力与离心时间(t)长短间的关系:

t1×RCF1=t2×RCF2

例1:Js5.2转子的zui大半径为22.6cm,当该转子以4000RPM运转时,可以算出离心管底部的RCF=4050g,离心10分钟能得到满意的结果,如果换用Js4.2转子(Rmax=254mm)仍用4000RPM转速,它的RCF为4550g,也许500g的差异会影响实验结果,为了获得同样的离心效果,可根据:

t1=t2×RCF2/RCF1=10×4050/4550=8.9分

因此,Js4.2转子4000RCF离心8.9分钟的离心效果与JS5.2(rMAX=226mm)来重复上述条件则可算出所需的运行转速(n)。

n=1000√3430/1.12×226=3681r/min

也就是说JS5.2的离心速度为3681rpm时,产生的RCF是3430g。

 

二、离心技术常用的数学计算

W/w%、w/v%的换算及蔗糖母液的稀释:

用重量/重量百分数(w/w%)表示的浓度,在数值上与用重量/体积百分数(w/v%)表示的浓度相差极大,例如65%(w/w%)的蔗糖溶液在0℃时相当于86%(w/v%)。而对氯化铯(CsCl),这二者的差别就更大,如53%(w/w%)的CsCl相当于87%(w/v%)。

例:设有密度为1.638g/ml重量百分比浓度为32%(w/w)的氯化铯求其重量/体积百分数(w/v%)

由公式Cw/v=Cw/ρ可知

Cw/v=32/100×1.638=53%

为方便一般可先配制较浓的母液如66%(w/w)的蔗糖溶液66%(w/w)

蔗糖溶液=2.55M=53%(w/v)折光指数=1.4558密度=1.3224g/ml在稀释时根据下面公式换算

V稀释后的体积×C稀释后浓度

V母液=C母液后浓度(w/v)  

例:现有66%(w/v)的蔗糖溶液(p=1.3224),当配100m120% (w/w) (p=1.081)的蔗糖溶液时需要母液量如下:

V母液=100×1.081×20%/1.3224×66%=24.8ml

因此,取母液24.8ml,加水至100ml即成20%(w/w)的蔗糖溶液。

B.总离心效果ω2T及ω2T积分值的应用

离心过程中往往包括启动、加速、恒速、减速及运转终止等阶级,在离心机转子从静止开始被加速过程中,加在样品上的相对离心力也逐渐增大,在减速时,情况恰恰相反,一些较大的转子,其加、减速过程延误时间较长,对于较粗略的实验,往往简单地以恒速阶段的离心效果ω2T来表示,如进行较精密的分析实验,应将这段时间内样品粒子的移动纳入考虑的范围,除了恒速阶段的离心效果外,还要加上加、减速过程的离心效果,因此引入了总离心效果--TCE(total centrifugal effect)并用∫ω2d t来表示,即ω2T的积分值。

∫ω2d t总离心效果用于计算粒子的沉降子数(S)。

S=1nr2 /rl /∫ω2d t=1nr2 /r 1/ TCE

r1:离心前粒子与轴心距离

r2:离心后粒子与轴心距离

目前Backman公司等一些生产厂家配有自动的ω2T积分器,当设置转速和运转时间后。全自动算出ω2T的积分值或设置ω2T值只需设一恒定的速度,离心机会自动确定所需的离心时间。

在设有ω2T自动积分器的情况下,可以利用ω2T图来计算总的离心效果,并可得到满意的结果,Backman公司给出了SW50.1等十种转子的ω2T图。这些图中虽只标出了二种密度曲线,对于其它密度可根据该二种密度曲线来估计所需的时间,也可以计算粒子的沉降系数。

例:计算离心时间

根据所希望的粒子的沉降位置从图中找出相应的Sω2T值

已知条件:实验用转子:SW50.1离心用介质:5-20%蔗糖密度:1.8g/ml,温度:20℃,转速:40000rpm,粒子沉降系数:30S=3x10Q。求:粒子在90mm处形成离心带需离心时间。

解:从SW50.1转子的Sω2T曲线图上可以查得总离心效果Sω2T=0.54

据ω2T=Sω2T/S=0.54/30=1.8

根据角速度ω和转速度RPM之间的换算公式ω=0.10472RPM

因此:ω2=(0.10472RPM)2=1.75×10所以:T=ω2T/ω2=1.8×10/1.75×10=10286秒

C.氯化铯(CsCl)沉降平衡曲线的应用

在实际工作中,往往从文献中查得分离某一物质的运行参数(温度、速度、起始密度等),但是,如果查不到这些参数,那么,究竟在什么条件下进行等密度离心,才能使离心结果满意呢?

在等密度离心中,常用氯化铯作梯度物质,所以Backman公司的每个转子说明书中都附有该转子的CsCl沉降及平衡曲线,利用这些曲线,就可得到zui合适的运行参数。

 

三、离心分离的几种方法

制备型超高速离心机的几种分离方法:

A.差速离心:逐次增加离心力,每次可沉降样品溶液中的一些组份。

差速离心是一种zui常用的方法。在这种方法中,离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在一定速度下一定时间的离心后,就可得到两个部分:沉淀和上清液。

通常在*次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到得上清液可以进行一步的离心,把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当,使大部分不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行一步的离心,直到达到所需要的分离纯度为止。

1、差速离心的特点是操作简单,但分离纯度不高。

B.密度梯度离心法:可以同时使样品中几个或全部组份分离,具有很好的分辨率。

1)速率区带法(rate zonal):

根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步骤如下:

在离心管中装入密度梯度溶液,溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加(正梯度)。

将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。

由于不同大小的粒子在离心力作用下,在梯度中移动的速度不一样,所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。

注意:样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。

2)等密度离心法(isopycnic):

根据粒子的不同密度来分离。离心过程中,粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度液粒上面或均匀分布在密度必须梯度中。经离心后,样品粒子达到它们的平衡点。注意:平衡后粒子的分离完全由其密度决定,与时间无关,此时再改变离心转速,只能改变区带的相对位置。

2、密度梯度分析法

1)、梯度介质性质与选择:

A.应具备的性质:

梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求,一个理想的密度材料标准它应是:

l 所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。

l 具有某些性质,如折射率,据此可测定它的浓度。

l 所形成的溶液粘度低。

l 不损伤所分离的样品。

l 离心分离后容易除去。

l 不妨碍离积分的分析。

B.常用介质种类:

表一、常用梯度材料在20℃密度

C.梯度介质应用范围:

表二、等密度梯度介质的应用

+++很好 ++好 +可以 --不适用

表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度

2)、梯度溶液的准备:

计算

稀释(本文第三章*部分)

3)、梯度形状

梯度形状分:线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。(如下图)

梯度形状对于分离是否成功非常重要:

zui常用的是线型梯度,适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒;等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品;不连续或阶梯型梯度zui适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力,适D.梯度柱制备:

梯度液柱可以用手工或梯度仪制备。

半注法:

为缩减离心时间,或分离样品较少可用半注法:下半管铺置梯度介质,中间加样品,上面铺Buffer或液体石蜡油。

4)、加样方法与加样量:

将样品加到梯度液柱上,针尖和离心管成45-60°角度,慢慢地将样品沿管壁流到液面上去,对于DNA一类易断的脆弱样品,应该用孔径较大的移液管代替针头,以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱zui小密度的1/10(W/W)。

5)、转子的选择与效应:

6)、分离区带的回收及检测

离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种:

a.穿刺法:

穿刺离心管底部,使梯度溶液滴出,将一具有适合阀门的盖帽放在离心管顶,可控制滴出速度。

b.虹吸法:

将一毛细管轻轻插入管底,尽量防止梯度抖动,用微量泵逐渐滴取,以一定量滴数或体积部分收取。

c.加压法:

通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部,部分收集换出的溶液。

d.切割法

采用专用的切割刀切割所需区带。

区带检测:

所谓区带检测,实际上是对水平转子或角转子和垂直转子离心管中的分离物质所做的监测,通常只是测量在260或280mm时长的吸收值,以决定梯度中的核酸或蛋白的整个分布,这个操作通常称之为在线(on line)监测。

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